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根瘤农杆菌介导的甘草遗传转化体系建立

标题: 根瘤农杆菌介导的甘草遗传转化体系建立
作者: 李兴欣
出版时间: 2016-05-17
所在大学: 河北农业大学
关键词: 乌拉尔甘草,再生体系,根瘤农杆菌,遗传转化体系
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 葛淑俊
专业: 作物生物技术
摘要: "甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是豆科甘草属灌木状草本植物,以干燥的根和根茎入药,是我国传统大宗常用药物.野生甘草资源因过度采挖趋于枯竭,人工种植甘草成为缓解供需矛盾的主要途径.但人工栽培甘草中药用成分甘草苷含量通常达不到药典规定的入药标准,因此建立甘草高效遗传转化体系,研究甘草苷合成相关基因的功能及其作用机制成为甘草品质改良研究的重要内容.本研究针对目前甘草再生体系稳定性差,缺乏高效遗传转化体系的现状,以乌拉尔甘草为试验材料,对培养基成分和外植体类型等影响甘草离体再生的因素进行了探讨,建立了甘草高效稳定植株再生体系.以根瘤农杆菌EHA105为载体,介导甘草苷合成关键基因CHI转化甘草,建立了高效根瘤农杆菌介导的甘草遗传转化体系.主要研究结果如下:1.三种外植体的不定芽分化能力存在很大差异.子叶不能直接分化不定芽;子叶节不定芽分化率最高为8%,平均每个分化的子叶节只能形成1-2个不定芽;而子叶节不定芽分化率高达90%,平均每个分化的去子叶胚能够形成3-5个不定芽,不定芽数≥3的分化率可达80%,所以去子叶胚是进行甘草离体再生及遗传转化的最适外植体.2.尽管去子叶胚在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基上分化率较高,但分化过程中发生较严重玻璃化,降低继代培养基中6-BA的浓度,无法使已玻璃化个体恢复正常.用6-BA2.0mg/L水溶液浸泡过夜的种子制备去子叶胚,于MS+6-BA0.5mg/L培养基上诱导分化,不但使去子叶胚的分化率升高,而且使玻璃化率由13%降为7%.3.试管苗转接种于生根培养基上后,约在第7d产生可见不定根,在MS和1/2MS+IAA0.5mg/L培养基上生根率分别为77%和60%,而在1/2MS培养基上生根率可达93%.4.对甘草PPT敏感性进行了实验,根据筛选出转化子的同时对植物的伤害最低原则,分化培养基和生根培养基中适宜的PPT筛选压分别为2.0和1.0mg/L.5.研究了侵染菌浓度、侵染时间、AS浓度、共培养时间等因素对阳性苗率的影响.最适宜甘草遗传转化的侵染菌浓度OD600=0.5,侵染时间为30min;共培养基中AS最适浓度为50mg/L,最佳共培养时间为4d.在这一转化条件下,阳性苗率高达10%.6.对抑菌剂Cef的使用浓度进行了选择,当分化培养基中Cef浓度为300mg/L,去子叶胚的存活率达83%;生根培养基中Cef为200mg/L时,试管苗污染率为0,生根率为90%.所以分化和生根培养基中适宜的Cef浓度分别为300mg/L和200mg/L.本研究建立的甘草高效再生体系和便于检测的遗传转化体系为甘草药用成分合成相关基因的功能验证及其调控机制研究打下了基础."