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转人α-乳清蛋白基因克隆牛中外源基因整合位点的检测及分析

标题: 转人α-乳清蛋白基因克隆牛中外源基因整合位点的检测及分析
作者: 王敬姣
出版时间: 2016-05-17
所在大学: 河北农业大学
关键词: 转基因克隆牛,人α-乳清蛋白,TAIL-PCR,整合位点,侧翼序列
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 李世杰
专业: 微生物与生化药学
摘要: "近些年来,转基因技术和体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer, SCNT)相结合使得转基因动物的生产效率有了很大的提高,然而外源基因整合到受体染色体上的整合机制还不是很清楚.本研究主要利用TAIL-PCR和Junction PCR等方法对5头通过SCNT技术得到的转基因克隆牛的整合位点进行克隆,并对整合位点的特征进行了分析,以期为揭示外源基因整合到受体染色体的机制提供依据.所得结果如下:1.应用TAIL-PCR对5头转人α-乳清蛋白基因克隆牛的外源基因的插入位点的3′侧翼序列进行克隆,得到了26条3'侧翼序列,并依据其特征将其分成A,B和C三种整合类型.2.在26条3'侧翼序列中存在一个共同的特征,即当外源基因整合到受体染色体上时,外源片段的3'均在第15821个核苷酸处发生断裂,并且和染色体上的一段大小为200-300bp左右的未知序列相连,命名为UN1,其中227bp在不同3'侧翼序列中完全一致.而在B和C类型的3'侧翼序列中,发现有另一段未知序列,命名为UN2.3.通过TAIL-PCR未能得到5'侧翼序列,但是通过5'特异引物PCR方法,我们分别得到了样本081223,样本172和样本189的1条5'侧翼序列,与3'侧翼序列结合,构成三个完整的整合位点.在外源基因整合到染色体上的相接处发现了拓扑异构酶I的酶切位点.4.在样本081223中,外源基因整合在牛的1号染色体的基因组克隆中.分析发现外源基因5′端缺失417bp,3′端缺失3875bp,并且由于外源基因的整合造成了46bp的染色体缺失,外源基因的3′末端与染色体之间插入了一段262bp的UN1片段.5.样本172中外源基因整合在牛的2号染色体的基因组克隆中,分析发现外源基因5′端缺失482bp,3′端同样缺失3875bp,并且由于外源基因的整合造成了76bp的染色体缺失.外源基因的3′末端与染色体之间插入了一段263bp的UN1片段.6.样本189中外源基因整合在牛的24号染色体的基因组克隆中,分析发现外源基因5′端缺失290bp,3′端缺失3875bp,并且由于外源基因的整合造成98bp的染色体缺失.外源基因的3′末端与染色体之间插入了一段266bp的UN1片段.以上研究结果说明,当外源基因插入到受体基因组时,受体染色体发生了复杂的重排,导致了外源基因和受体染色体不同程度的缺失;在不同的转基因样本中,插入位点存在着一定的共同特征,以上研究结果将为探寻转基因插入位点的规律提供重要依据."