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农杆菌介导β-1,3-葡聚糖酶基因转入嘎拉苹果的研究

标题: 农杆菌介导β-1,3-葡聚糖酶基因转入嘎拉苹果的研究
作者: 张丽丽
出版时间: 2007-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 苹果,葡聚糖酶基因,抗病育种,再生体系,根癌农杆菌,遗传转化,PCR
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 师校欣%杜国强
专业: 果树生物技术
提交时间: 2007
摘要: 本研究以苹果(Malus domestica Borkh)主栽品种嘎拉(Gala)组培苗为试材,系统研究了影响叶片离体再生及叶盘法遗传转化效率的若干因素,优化了苹果离体叶片再生不定芽系统和遗传转化系统;以农杆菌EHA105为介导将目的基因——β-1,3-葡聚糖酶抗病基因导入苹果品种,成功获得了转化植株,为今后苹果遗传转化及抗病性研究提供了依据。试验结果表明: 1.苹果不同外植体再生不定芽能力不同,以叶片的再生效果优于白化茎段。 2.继代苗苗龄对嘎拉叶片不定芽再生效率无明显影响,但考虑到取材的难易,以继代培养20~30d为宜。 3.苹果离体叶片再生过程中,前期暗培养可以显著提高叶片再生频率。暗培养时间以14~21d为宜,随暗培养时间延长再生频率虽没有降低趋势,但是再生芽黄化现象严重,不利生长。 4.接种方式对嘎拉苹果的叶片再生效率影响不显著,但对再生芽数的影响显著,以近轴面朝上接种再生芽数多。 5.在根癌农杆菌EHA105介导的遗传转化体系中,以叶片为转化受体,适宜的卡那霉素(Kan)选择压为10mg/L,抑菌抗生素为头孢霉素(Cef)300mg/L。 6.研究了影响叶盘法遗传转化的因素,优化了遗传转化途径:外植体在分化培养基上预培养1~2d;农杆菌悬浮至对数生长期,菌液浓度为OD<,600>=0.6~0.8时侵染外植体10min;共培养1~2d;然后脱菌、选择同时进行,每隔20d左右更换一次选择培养基。 7.共有19个转化株系通过了Kan抗性检测,具体包括三个方面:①转化株在附加Kan50mg/L的继代培养基上能够连续增殖继代,生长正常。②转化株叶片在附加或未加Kan50mg/L的再生培养基上的再生能力无明显差异。③转化株在附加Kan50mg/L的生根培养基中能正常生根。 8.通过Kan抗性筛选的转化株系经GUS检测,均出现蓝色斑点,进一步经PCR扩增检测,转化株系扩增出的特异条带和阳性对照一致,表明Glu基因已整合至嘎拉苹果基因组DNA中。