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拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆与体外表达

标题: 拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆与体外表达
作者: 寇红梅
出版时间: 2007-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 拟南芥,抗灰葡萄孢,抗病基因,TAIL-PCR,基因克隆,体外表达,组织病理学
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 董金皋
专业: 植物学
提交时间: 2007
摘要: 为了获得拟南芥抗灰葡萄孢相关基因,在拟南芥Col-0生态型可以抵抗灰葡萄孢侵染的基础上,将51,600个此生态型的T-DNA插入突变体接种该病菌以后,选定单拷贝的感病突变体AbosA(Botrvtis susceptible mutant)为进一步的试验材料,提取其DNA,利用TAIL-PCR技术获得了插入片段的侧翼序列,在http://www.arabidopsis.org和www.ncbi.nih.gov网站上,对得到的侧翼序列运用BLAST软件分析,发现T-DNA插入位点在ATlg01800基因(命名为bosA)的第4个外显子处,AT1G01800属SDR(short-chain dehydrogenase/reductase)家族蛋白,将该基因进行原核表达后,提取活性蛋白发现对灰葡萄孢没有直接的抑制作用。经过生物和非生物胁迫发现该基因在诱导抗病中起作用。 试验从51,600个拟南芥T-DNA插入突变体中筛选到12个灰葡萄孢的感病突变体。通过接种后表型鉴定和在细胞水平上进行组织病理学染色观察发现,感病突变体在接种第1d就有少许的死细胞出现,且随着接种时间延长细胞坏死速度加快,接种第5d后叶片上出现肉眼可见的水渍状病斑,第8d,整个叶片干枯死亡,在显微镜下可以看到死亡的叶片细胞内充满了灰葡萄孢的菌丝。而野生型Col-0植株的叶片上只出现了过敏性坏死斑。 将得到的12个感病突变体进行了Southern杂交验证了T-DNA插入片段的拷贝数,选定了T-DNA插入为单拷贝的134号突变体(命名为△bosA)为进一步研究对象。TAIL-PCR技术是扩增已知序列的侧翼未知序列的一种方法,本试验经过对TAIL-PCR的多个影响因素进行了优化,并利用优化的TAIL-PCR条件扩增插入片段的左侧侧翼序列,经BLAST软件分析获知插入位点为bosA基因的956与957位碱基之间。初步确定该基因与抗灰葡萄孢相关。 bosA基因编码一个分子量为31.66KD且pI为5.03的蛋白,属于短链的脱氢酶/还原酶家族蛋白(shoa-chain dehydrogenase/reductase(SDR)),具有氧化还原酶活性。将体外表达的BOSA活性蛋白与灰葡萄孢共培养,发现蛋白对病菌没有直接的抑制作用;△bosA接种芸苔链格孢以后,表现出与野生型不同的症状:接种细菌Pst.DC3000后,AbosA表现出比野生型的感病性增强。因此可以确定bosA基因对灰葡萄孢的抗性不是属于基因对基因的抗性模式,而是属于诱导抗病性的模式。对该突变体进行了一系列的非生物胁迫,发现bosA基因在抵抗某些非生物胁迫中也起着重要作用。经过DAB染色法研究发现,在接种灰葡萄孢以后,突变体的H<,2>O<,2>的含量明显的高于野生型,且在第2d达到最大量,由此可以得知,该突变体对灰葡萄孢增强感病性与ROIs(Reactive Oxygen Intermediates)相关。