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水稻蛋白质芯片的设计、构建及初步验证

标题: 水稻蛋白质芯片的设计、构建及初步验证
作者: 靳苗静
出版时间: 2007-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: POOLING系统,水稻,蛋白质芯片,蛋白激酶,底物
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 李莉云%刘国振
专业: 生物化学与分子生物学
提交时间: 2007
摘要: 水稻是世界上最重要的粮食作物之一,是研究作物产量、转基因、杂种优势、植物病虫害抗性和其它抗逆等方面的重要遗传材料,也是基础研究的模式植物之一。水稻的生长发育过程几乎都与蛋白激酶引起的信号转导过程有关,研究激酶尤其是其磷酸化过程和筛选其下游底物,了解植物发育调控机理尤其是抗逆机理,对农业生产具有重要的意义。 本试验建立了一种基于Pooling系统的水稻蛋白质芯片的方法,每个样品接取10个水稻根eDNA库克隆,诱导表达后,用溶菌酶高通量地裂解提取蛋白质,总共提取了60板(96孔板)来自于水稻cDNA库表达的β-gal融合蛋白质,共6000个样品,大约涵盖60000个克隆;再把所提取的蛋白质进行lO倍的Pooling,得到Pooling之后的蛋白质样品15板,所含样品数为1200个。应用Dotblotting的方法,检测了所有混合蛋白质的基本表达情况,另外表达了一板蛋白质,包括57个GST-水稻蛋白激酶和4个MBP-水稻蛋白质,将所有这76板蛋白质点在同一张芯片上。用Anti-β-gal和Anti-GST杂交芯片检测芯片质量,并利用该芯片对水稻蛋白激酶PI-D2进行了作用底物初步筛选的研究。结果如下: 1.基于Pooling的方法,表达了大约60000个水稻根cDNA克隆的蛋白质。 2.利用溶菌酶裂解的方法,方便地同时提取多个蛋白质,满足了构建水稻蛋白质库需大量提取蛋白质的需要。 3.用Dot blotting方法检测了基于Pooling系统提取的水稻库混合蛋白质的表达情况,结果表明,蛋白质库质量的表达水平能够用来点制水稻蛋白芯片。 4.制备了含有7271个蛋白质样品的水稻蛋白质芯片,并用Anti-β-gal和Anti-GST抗体对水稻蛋白质芯片进行质量检测,结果说明蛋白芯片质量较好。 5.用该水稻蛋白质芯片,进行了水稻蛋白激酶PI-D2作用底物初步筛选的研究,获得了一些可能的候选底物。 基于Pooling构建的水稻蛋白质芯片,减少了工作量,节约了成本和试剂用量。该芯片可能具有多种用途,如:研究蛋白质和蛋白质之间的相互作用、蛋白质和DNA之间的作用、蛋白质和脂类之间的作用、蛋白质和药物之间的作用等。其中用于水稻蛋白激酶底物的筛选为其中的典型应用,可以系统化的筛选激酶底物,从而对水稻信号转导过程有进一步的了解。