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水稻蛋白激酶的高通量克隆、表达及抗稻瘟病蛋白激酶PI-D2作用底物的初步筛选研究

标题: 水稻蛋白激酶的高通量克隆、表达及抗稻瘟病蛋白激酶PI-D2作用底物的初步筛选研究
作者: 李莉云
出版时间: 2007-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 水稻,蛋白激酶,自我磷酸化,稻瘟病,激酶底物
论文级别: 博士
学位: 学位论文
导师: 刘国振
专业: 植物学
提交时间: 2007
摘要: 植物蛋白激酶参与各种细胞代谢过程,包括生长发育、表达调控、逆境反应、信号传导等。这些激酶大多数居于各种信号传导途径的节点,与它们的上下游蛋白质组成了一个复杂而有序的网络,调节着植物的正常生长发育和对外界环境的反应。基于完成的水稻基因组序列,通过同源序列比对分析表明水稻基因组中存在1661个激酶序列。鉴于蛋白激酶的重要性和特殊性,克隆并表达这些激酶,是其功能研究的重要组成部分。本实验利用公布的水稻激酶序列,选取功能有代表性并且其基因内部没有内元的32个序列,通过PCR扩增获得水稻激酶区的编码序列,克隆于酵母表达载体pEGH上,在酿酒酵母Y258菌株中表达融合蛋白质,并进行了自我磷酸化活性分析。结果如下: 1.PCR扩增得到了30个水稻激酶区的编码序列; 2.在酿酒酵母系统中表达了27个激酶的GST融合蛋白质,表达量约为0.5-5mg/L培养基; 3.对获得的蛋白激酶进行了分类和功能预测:按照PlantsP网站(http://plantsp.genomics.purdue.edu/)的激酶分类系统,本实验表达的激酶分别属于第一类跨膜受体激酶和无跨膜区的激酶中的7个不同组,即第2组的Receptor Like Cytoplasmic Kinase Ⅶ家族、第3组的CRPK1L(Type 1)家族、第4组的Crinkly 4_Like kinase家族、第6组的Plant External Response Like Kinase家族、第9组的CRPK1 Like Kinase(Types 1 and 2)和S-Domain Kinase(Type 2)家族、第11组的Legume Lectin Domain Kinase家族和第17组的Wall Associated Kinase kinase家族; 4.自我磷酸化分析表明,21个激酶具有自我磷酸化活性,其中Os07g38230、 Os07g03810、Os01g06280、Os03g21540、Os04g52860、Os03g12470、Os01g48000、 Os01g65030和Os03g61310自我磷酸化活性较强,它们分别属于Legume Lectin Domain Kinase、Receptor Like Cytoplasmic Kinase Ⅶ、CRPK1 Like Kinase、Wall associate kianse和S-Domain kinase等5组; 5.激酶近膜区结构域对大多数植物类受体激酶的磷酸化活性是必需的。 激酶往往通过使其底物磷酸化而发挥功能,所以鉴定激酶的底物是了解激酶调控网络和探讨激酶作用机理的重要环节。Pi-d2是水稻稻瘟病抗性基因,编码一个类受体激酶,其抗病机理研究具有重要的理论与应用价值。本研究利用酿酒酵母表达的PI-D2蛋白激酶,通过cDNA表达文库和蛋白质芯片技术进行了底物的筛选,并对酵母双杂交实验筛选的结合蛋白质进行了磷酸化实验。结果如下: 1.通过固相磷酸化实验,从水稻cDNA表达文库中筛选到6个可能的。PI-D2作用底物; 2.克隆了水稻20S蛋白酶体的α 5亚基的编码基因,并在大肠杆菌中进行了体外表达; 3.体外磷酸化实验表明,PI-D2可以使20S蛋白酶体的α 5亚基磷酸化: 4.PIB1是酵母双杂交获得的PI-D2的结合蛋白质之一,属于带ARM结构的U-box蛋白质,本实验证明PI-D2可以在体外磷酸化PIB1蛋白质; 5.利用本实验室建立的水稻蛋白质芯片体系,进行了规模化PI-D2的磷酸化底物的筛选实验,获得了多个可能的侯选底物。 本实验建立的水稻蛋白激酶高通量克隆、表达和激酶底物筛选的实验体系,为抗病、抗逆及发育调控机理研究以及蛋白激酶的功能基因组学研究提供了良好的技术平台。