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根癌农杆菌介导的抗寒基因转录因子CBF转化苹果的研究

标题: 根癌农杆菌介导的抗寒基因转录因子CBF转化苹果的研究
作者: 杨丽丽
出版时间: 2006-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 苹果,抗寒基因,转录因子CBF,根癌农杆菌,遗传转化,再生不定芽,转基因技术
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 杜国强
专业: 果树学
提交时间: 2006
摘要: 本研究以苹果(MalusdomesticaBorkh)营养系砧木M26和栽培品种嘎拉试管苗为试验材料,以农杆菌EHA105为媒介把目的基因——抗寒基因的转录因子CBF导入苹果。通过对影响叶片、白化茎段离体再生不定芽和根癌农杆菌(Agrobacterium)EHA105介导的遗传转化效率的若干因素的研究,优化了苹果再生不定芽系统和遗传转化系统,并成功将CBF基因导入到了苹果的基因组中。 主要研究结果如下: 1.苹果不同外植体再生不定芽能力不同,以白化茎段的再生效果优于叶片。适宜苹果白化茎段不定芽再生的体系为:继代苗暗培养20天左右获得白化茎段,取1~2节位的白化茎段切成0.5cm的小段,接种(平放)在MS培养基上,暗培养2~3周就会有芽点出现。M26和Gala的不定芽再生效率均达到95﹪以上。 2.培养基中添加适宜浓度的BA(5.0mg/L)和TDZ(1.0mg/L)可使M26白化茎段不定芽再生达到较高的水平,但TDZ的使用会增加再生芽的玻璃化现象,以5.0mg/L的BA用于M26白化茎段不定芽再生较为适宜。 3.白化茎段的褐化现象比叶片严重,在再生培养基中添加100mg/LVc可以抑制褐化现象的发生,1mg/L的AgNO3提高苹果不定芽的再生效率;当Vc浓度超过400mg/L或AgNO3浓度超过3mg/L时,将抑制苹果白化茎段不定芽的再生,且白化茎段伤口处褐化现象加重。 4.继代苗苗龄对白化茎段不定芽的再生有很大影响:取自继代培养20~25天的白化茎段上取材的1~2节位的茎段,再生频率最高。低于此苗龄白化茎因抽生太短不利于取材,而高于此苗龄,茎段分化率明显降低,并且褐化现象加重。 5.在根癌农杆菌EHA105介导的遗传转化中,当以白化茎段和叶片为转化材料时,有效的Km选择压分别为12mg/L和10mg/L;适宜的头孢霉素浓度为200mg/L。 6.乙酰丁香酮(AS)可以诱导vir区基因的表达,促进T-DNA的转移,在侵染液和共培养培养基中添加30μmol/L的AS可以提高苹果的基因转化效率。 7.通过对影响农杆菌介导转化的各种因素进行筛选,得到了一条最佳的转化途径:外植体在分化培养基上预培养1天;农杆菌活化至对数生长期,菌液浓度为OD600=0.6左右;侵染外植体10min;共培养2天;然后脱菌、选择同时进行。 8.共有12个转化株系通过了卡那霉素抗性检测,具体包括三个方面:①转化株在附加卡那霉素50mg/L的继代培养基上能够连续增殖继代,②转化株叶片在附加卡那霉素30mg/L的分化培养基上的再生能力同在无卡那霉素的培养基上的再生能力无明显差异,③转化株在附加卡那霉素30mg/L的生根培养基中能正常生根。 9.通过卡那霉素抗性筛选的植株经PCR结果表明:在检测的植株中有一株扩增出的特异条带和阳性对照一致,阴性对照未能扩增出任何条带。表明CBF基因已整合到这棵植株的基因组DNA中。 10.转化株经4℃低温胁迫处理后,植株体内游离脯氨酸的积累在低温胁迫18h后骤然增加,增加幅度明显高于未转化株。