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多重PCR快速检测三种食源性致病菌的研究

标题: 多重PCR快速检测三种食源性致病菌的研究
作者: 赵卫国
出版时间: 2012-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 单增李斯特氏菌,金黄色葡萄球菌,变形杆菌,多重PCR
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 张伟%段文仲
专业: 食品安全与加工
提交时间: 2012
摘要: 近年来,全球食品安全事件频发,突发事件频率高是食品安全问题的一个显著特点,在这些事件中,病原菌的污染是引起食源性疾病的主要因素之一.加强食品检验力度是有效预防病原菌传播及食品中毒的最有效途径.目前,食源性致病微生物主要采用传统的培养方法,即分离、培养然后生化鉴定,操作繁琐,检测时间较长,通常需4-7d才能完成,且每次只能检出一种致病菌,灵敏度较低.近年来,PCR技术发展十分迅速.多重PCR技术可以实现在一个反应管中同时对多种致病微生物的检测,具有高效、低成本、高灵敏度等优点.因此,本研究建立了食品中单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌的多重 PCR 检测技术.
本文根据单增李斯特氏菌的基因 hlyA、金黄色葡萄球菌的 nuc 和变形杆菌的atpD基因设计了3对特异性引物,进行多重PCR反应,可实现对三种致病菌的同时检测.对其扩增产物测序,与Genebank上目的序列进行同源性比对,以验证三对引物的特异性.本研究选取大量菌株进行性特异性验证,结果显示设计的单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及变形杆菌引物均能特异性地扩增出174bp、238bp、508bp 的目的片段,其他菌株均为阴性.还进一步将三种菌株DNA进行随机组合进行多重PCR反应检测其反应的特异性,结果显示均能扩增出特异性目的片段.由此可知,多重 PCR 检测方法特异性强,可用于同时检测三种致病菌的一种或几种.
本研究对多重PCR反应体系进行了优化,试验过程中对镁离子和引物的添加量、dNTP的添加量、Taq酶的添加量、和退火温度进行优化.最终确定了多重PCR反应的最佳反应体系和最佳反应条件.反应体系:10*Easy Taq Buffer(-Mg2+) 2.5μL,2.5 mM dNTPs 2μL,50 mM MgSO4 1μL,单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的上下游引物各 1.5 μL(10 μmol/L),变形杆菌的上下游引物 1.0 μL(10 μmol/L),模板DNA 2μL,5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.5μL,ddH2O补足25μL.PCR反应程序为:94℃预变性5 min, 94℃变性45 s,63.1℃退火45 s, 72℃延伸30 s,30个循环.
本研究共检测了13株菌,2株变形杆菌、2株金黄色葡萄球菌、1株单增李斯特菌均为阳性结果;8 株其它肠杆菌均为阴性结果,从而验证多重 PCR 引物特异性.将三种致病菌随机混合,加入3对引物进行扩增,均能够特异性扩增出相应条带,从而证实该多重PCR反应特异性较强.
本方法对三种食源性致病菌纯菌培养物单菌检测灵敏度均为103cfu/mL;同时检测三种食源性致病菌的灵敏度均为103cfu/mL.该研究还对人工污染的肉及肉制品中三种致病菌进行检测,确定其检出限均为103cfu/mL.