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多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究

标题: 多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究
作者: 杨国兴
出版时间: 2008-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 食品安全,食源性致病菌,食物中毒,凝胶成像系统
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 张伟
专业: 微生物学
提交时间: 2008
摘要: 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点,在各种食品安全事件中,细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。常见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、致泻性大肠杆菌等。目前,国内检测食品中致病菌主要采用传统的培养方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3~5 d才能完成,且灵敏度较低。近年来,PCR针对某一种或一类致病菌的检验方法被建立起来,但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费。因此,急需建立一种快速有效且通量较高的检测方法。 本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、单核增生李斯特氏菌的内化素A基因inlA设计了四对特异性引物,进行多重PCR反应,可同时实现对四种食源性致病菌的检测。试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化,确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序,其反应体系为:5μL10xPCR buffer,3.5μL 25 mmol/L Mg2+,5.5μLdNTPmixture,正向引物各2μL,反向引物各2μL,0.8μL(5UμL-1)Taq酶,模板为FTA膜,双蒸水补足至50gL;多重PCR.扩增程序为:多重PCR反应采用冷启动,94℃预变性5 min,94℃变性1 min,55.5℃退火45s,72℃延伸1 min,35个循环,72℃终延伸5 min,反应产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果对多重PCR.扩增产物进行了DNA测序,登录Genebank将测序结果进行网上blast,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。 本研究共检测了20株菌,2株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌、4株志贺氏菌、1株单核增生李斯特氏菌均为阳性结果;9株其它肠杆菌均为阴性结果。将四种致病茵随机组合,均能够准确检测出结果,因此该多重PCR反应特异性较强。 本方法对四种食源性致病菌的纯菌培养物单茵检测灵敏度均为lO1cfu/mL:同时检测四种食源性致病菌的灵敏度金黄色葡萄球菌为102 cfu/mL、沙门氏菌102cfu/mL、志贺氏菌101cfu/mL、单核增生李斯特氏菌lO1cfu/mL。 对实际样品进行检测,将多重PCR.方法与国标进行比较,确定多重PCR方法对四种致病菌的敏感性均为100%;特异性分别为:金黄色葡萄球菌为95.%、沙门氏菌为95.7%、志贺氏菌为91.3%、单核增生李斯特氏菌为94.1%;符合率分别为98%、98%、96%、94%。 本方法使用FTA滤膜处理样品,再通过多重PCR方法同时检测人工污染肉及肉制品中四种致病菌,金黄色葡萄球菌检出限为102 cfu/g、沙门氏茵检出限为102 cfu/g志贺氏菌检出限为101 cfu/g、单核增生李斯特氏菌检出限为101 cfu/g。并且检测可以在6 h内完成,大大缩短了检测时间。为多重PCR快速检测食品中四种食源性致病菌构建了一个技术平台。