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苹果潜隐性病毒脱除及RT-PCR技术研究

标题: 苹果潜隐性病毒脱除及RT-PCR技术研究
作者: 李玲
出版时间: 2008-01-01
所在大学: 河北农业大学
关键词: 苹果病毒,RT-PCR技术,苗木培育,脱毒体系
论文级别: 硕士
学位: 学位论文
导师: 孙建设%邵建柱
专业: 果树学
提交时间: 2008
摘要: 苹果病毒具有危害性强、传播扩散快和难以治愈等特点。目前苹果病毒的危害在我国苹果生产上呈现上升势头,无病毒苗木的培育迫在眉睫。本研究以SH40苹果继代组培苗(组培苗丛芽)为试材,用热处理+暗培养+茎尖培养的方法对苹果的三种潜隐性病毒进行了脱除,研究了在38/32℃的变温热处理下暗培养对试材的生长量、存活苗的高度、增殖系数、存活率及脱毒率的影响,优化了脱毒体系,提高了脱毒效率。采用优化的RT-PCR方法对苹果三种潜隐性病毒进行检测,不但降低了成本且提高了效率。本试验做以下处理:①将室温下培养7d的组培苗丛芽置于GXZ型智能光照培养箱进行光培养,起点温度26/25℃,每天升高1℃,升至38/32℃后变温培养30d。②将室温下暗培养7d的组培苗丛芽置于GXZ型智能光照培养箱进行暗培养,起点温度26/25℃,每天升高1℃,升至38/32℃后变温培养30d。⑧将室温下暗培养2d的组培苗丛芽置于GXZ型智能光照培养箱进行暗培养,起点温度26/25℃,每天升高1℃,升至38/32℃后变温培养30d。④将室温下暗培养2d的组培苗丛芽直接置于38/32℃下变温暗培养30d。⑤将室温下暗培养7d的组培苗直接置于38/32℃下变温暗培养30d。结果如下: 1.热处理+暗培养的存活率、存活苗的高度及增殖系数均优于热处理+光培养的处理。分别为:对照(光培养)处理1:46%,2.1cm,2.1;处理2:65%,3.1cm,4.7:处理3:83%,3.0cm,5.6;处理4:81%,2.65cm,7.2;处理5:70%,3.7em,6.4。 2.预培养时间和培养条件(光/暗培养)对试材的影响,以处理4效果最好。然后取2mm的茎尖进行继代培养30d后,即可用于RT-PCR方法检测。该方法不但使得茎尖培养取材由传统的0.2mm增加到2mm,降低了显微操作的难度,而且大幅度提高了脱除病毒的效率。ACLSV、ASGV和ASPV的脱毒率分别为100%、93.3%、100%。 3.采用RNAplant试剂盒提取苹果组培苗总RNA,利用DNaseⅠ除RNA中的DNA,进而采用AMV反转录酶进行反转录。优化了RT-PCR体系,ACLSV的最佳参数为:Mgz2+:1.5mmol/L,TaqE的用量为2U,退火温度为58℃;ASGV的最佳参数为:Mg2+:2mmol/L,TaqE的用量为1.5U,退火温度为55℃;ASPV的最佳参数为:Mg2+:2mmol/L,TaqE的用量为1U,退火温度为55℃,RNA模板的用量均为1.0μl,PCR选用体系ACLSV:20μl;ASGV、ASPV;25μl。用优化的RT-PCR方法对苹果的三种潜隐性病毒ACLSV、ASGV、ASPV进行了检测。该体系在提高扩增效率的同时还大幅度降低了成本。